Профилактическое действие пробиотических культур в кисломолочных продуктах

Воззрения ученых, занимающихся данной проблемой в последние 15 лет, различаются (по требованию к количеству живых микроорганизмов, масштабу клинических испытаний, по отношению к наличию плазмид и т. д.), поэтому для единообразного понимания вопроса об уровнях воздействия пробиотических штаммов, находящихся в составе кисломолочных продуктов и функциональных продуктов питания (ФПП), в настоящем исследовании предлагаем пойти не от терминологических вариантов пробиотиков и условий, по которым культуры можно назвать пробиотическими, а от изучения уровней влияния пробиотических штаммов, входящих в кисломолочные продукты.

Не претендуя на универсальность классификации, выделим три взаимосвязанных уровня профилактического действия пробиотических культур, охватывающих, по нашему мнению, достаточно полно и равномерно все иммуномодулирующие функции пробиотиков:

– метаболическая антибиотическая активность;

– антагонистическая активность посредством бактериоцинов;

– клеточный и гуморальный иммунитет.

Метаболическая антибиотическая активность

Под метаболической антибиотической активностью понимаются антагонистические свойства некоторых культур, в частности молочнокислых, по отношению к технически вредной, патогенной и условно-патогенной микрофлоре, реализуемые за счет метаболитов — продуктов жизнедеятельности микроорганизмов с пробиотическим эффектом: молочной и других органических кислот, в т. ч. короткоцепочечных жирных кислот, углекислого газа, перекиси водорода, диацетила и др. Среди типичных продуктов жизнедеятельности молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий назовем также аминокислоты, витамины В₁, В₂, К, никотиновую, пантотеновую и фолиевую кислоты, пиридоксин, цианокобаламин, лизоцим и другие биологически активные вещества.

Принято подразделять нормальную микрофлору кишечника здоровых людей и животных на три группы:

– индигенная (постоянная, резидентная), которая, колонизуя поверхность клеток слизистой, примыкает к мембранам энтероцитов, или локализуется в непосредственной близости от поверхности эпителия, в слое муцина, прилегающего к клеткам ворсин в нижних отделах тонкого и толстого кишечника и образующего биопленку эпителия. Поэтому микроорганизмы, ассоциированные со слизистой оболочкой, еще называют мукозной микрофлорой (М-флорой), т. е. обитающей в толще слоя муцина, покрывающего эпителий, и составляющей микробно-тканевый комплекс кишечника, участвуя в примембранном пищеварении;

– аутохтонная, которую составляют бактерии, локализующиеся в просвете кишечника. Ее еще называют полостной (П-микрофлорой). Микроорганизмы аутохтонной микрофлоры в сотни раз менее устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с бактериями, находящимися в составе биопленки, но сравнительно более постоянны, чем аллохтонная микрофлора;

– аллохтонная (временная, транзиторная), находящаяся в желудочно-кишечном канале (ЖКК) 1–3 суток. Молочнокислые бактерии и бифидобактерии заквасок ферментированных продуктов, будучи аллохтонной микрофлорой или быстро лизированными в желудочно-кишечном тракте, за счет метаболитов формируют биопленку индигенной и аутохтонной микрофлоры, предотвращающей адгезию инородных микробов, конкурирующей за рецепторы и пищевые субстраты. Поэтому кисломолочные продукты можно называть метаболитными пробиотиками [2].

На метаболическом уровне более или менее эффективно, но работают все молочнокислые микроорганизмы, применяемые для производства ферментированных молочных продуктов (кисломолочных напитков, сметаны, ложковых йогуртов, творога, сыров и других продуктов, производимых с использованием закваски), осуществляя преобразование основных компонентов молока во вкусовые, ароматические, биологически активные вещества, участвуя в формировании консистенции продукта и подавляя размножение опасной для потребителей патогенной и условно-патогенной микрофлоры, как во время технологического процесса, так и находясь в ЖКК.

Основная задача исследования метаболической антибиотической активности молочнокислых культур, традиционно входящих в состав кисломолочных продуктов, в т. ч. ФПП, состояла в предварительной оценке перспективы использования названных культур и продуктов, их содержащих, в целях улучшения эпидемиологической ситуации по острым кишечным инфекциям (ОКИ). Среди ОКИ установленной микробной этиологии ведущее место занимают сальмонеллезы (возбудитель S. enteritidis или S. Infantis), эшерихиозы (возбудитель E. coli) и др. [4] Актуальной также является профилактика инфекций, вызываемых стафилококками и протеями семейства Enterobacteriaceae.

В опыте участвовало 16 культур молочнокислых микроорганизмов на первом этапе, 26 других культур на втором этапе. Источники культур — коллекции ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (г. Москва) и ФГУП «Экспериментальная биофабрика» (г. Углич). Антибиотическую активность определяли чашечным методом перпендикулярных штрихов [5]. Исследования показали:

– среди испытанных штаммов наибольшей антибиотической активностью ко всем тест-культурам патогенной и условно-патогенной микрофлоры обладают штаммы L. casei subsp. casei и L. рlantarum;

– среди штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus и L. acidophilus наблюдается значительная штаммоспецифичность по антибиотическому признаку. В обоих случаях выявлены штаммы, обладающие антибиотической активностью, превышающей среднюю по виду в 2–3 раза;

– хотя штаммы подвидов L. lactis обладают в целом самой низкой антибиотической активностью, отдельные штаммы проявляют зону задержки роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры 10 мм и более, что свидетельствует, наряду с проблемой фаголизиса этих культур [2], о необходимости систематической селекции в данном направлении.

Антагонистическая активность посредством бактериоцинов

Дополнительным механизмом антибиотической активности может быть выработка бактериоцинов — веществ с широким антагонистическим действием. Бактериоцины — это наиболее высокомолекулярные антибиотики белково-пептидной природы. Так, например, колицины имеют молекулярную массу 50 000–90 000 Da.

Известны лактоцины B, F, J, M, ацидолин и лактоцидин, продуцируемые L. acidophilus, булгарицин — L. delbrueсkii subsp. bulgaricus, лактобревин — L. brevis, гельветицин — L. helveticus, лактолин — L. plantarum, реутерин — L. reuteri. Эти бактериоцины ингибируют рост и размножение бацилл, клостридий, сахаромицетов, стрептококков, стафилококков, энтеробактерий, псевдомонад, листерий, грибов рода Candida [6–11].

В то время как антибиотики оказывают многочисленные побочные действия, негативно сказывающиеся на организме, бактериоцины и продуцирующие их штаммы посредством избирательного воздействия на микрофлору нормализуют микробный ценоз при некоторых патологиях у человека и животных. Именно с бактериоцинами в последнее десятилетие связывают большие надежды [1], т. к. они, в отличие от антибиотиков, которые действуют на «мишени» клеточной стенки бактерий и часто приводят к образованию антибиотикоустойчивых штаммов, образно выражаясь, «расстреливают» патогенную и условно-патогенную микрофлору, не оставляя ей шанса выжить.

Для исключения метаболической антибиотической активности за счет молочной и других органических кислот на этапе сравнения на среде без буфера и забуференных средах нами исследовано 18 культур L. acidophilus и 8 культур L. delbrueckii subsp. bulgaricus из указанных ранее коллекций. В качестве тест-культур использовали 10 штаммов патогенной и условно патогенной микрофлоры. В опытах использовались Staphylococcus, Рroteus, Salmonella, E. сoli и Listeria.

По результатам исследований, в данной выборке культур L. delbrueckii subsp. bulgaricus проявляют сравнительно более высокую антагонистическую активность, которая резко падает при увеличении степени буферизации среды и отсутствует при эквивалентном количестве буфера, поэтому является во всех случаях преимущественно кислотной. Культуры L. acidophilus чаще, а именно в 4 случаях из 18, что составляет 22,2 %, обладают смешанным механизмом антагонизма, возможно, включающим выработку бактериоцинов. Продолжается работа по идентификации метаболитов, обладающих антагонизмом к патогенной и условно-патогенной микрофлоре в нейтральной среде.

В свою очередь, бактериоцины среди других антигенов могут вызывать иммунный ответ. Иммуногенность антигена, т. е. способность вызывать иммунный ответ, зависит не только от его чужеродности, но и от молекулярной массы (молекулы массой менее 5000 Da обычно не иммуногенны).

Клеточный и гуморальный иммунитет

За клеточный иммунитет ответственны Т-лимфоциты, за гуморальный — В-лимфоциты. Активированные Т-клетки трансформируются в лимфобласты, которые дают начало нескольким субпопуляциям клеток [12]. Среди них активные Т-киллеры, Т- супрессоры, подавляющие иммунный ответ, Т-хелперы, интегрирующие иммунный ответ путем кооперации с В-лимфоцитами при выработке антител или путем стимуляции Т-киллеров. Активированные Т-лимфоциты всех популяций выделяют также растворимые факторы (лимфокины), которые регулируют проявления клеточного иммунитета (супрессию, кооперацию, приобретение специфических свойств Т-лимфоцитами) и инициируют фагоцитарную активность макрофагов.

Активированные антигеном В-лимфоциты становятся затем продуцентами антител. При первом контакте с антигеном происходит их начальная активация, или сенсибилизация. Некоторые из дочерних клеток превращаются в клетки иммунологической памяти, другие оседают в периферических лимфатических органах. Клетки иммунологической памяти не дают первичного иммунологического ответа, но при повторном контакте с тем же антигеном легко превращаются в клетки, секретирующие антитела.

Но если патогенная и условно-патогенная микрофлора индуцирует активную продукцию цитокинов и процессы воспаления, то антигены молочнокислых бактерий и бифидобактерий инициируют, «обучают» и «тренируют» иммунную систему. Доказана активация локальных макрофагов для увеличения презентации антигенов B-лимфоцитам и производства секреторного иммуноглобулина А (IgA) как местно, так и системно.

Установлено, что пробиотические бактерии стимулируют иммунную систему посредством увеличения численности и повышения активности фагоцитов, лимфоцитов, увеличения количества иммуноглобулинов, выполняющих роль противоядия, интерферона, действующего против вирусов, и др. Они умеренно увеличивают производство цитокинов, объединяющих иммунную систему человека, улучшая возможности организма быстро справляться с различными стрессовыми состояниями, физическими нагрузками, заболеваниями [13].

Однако для получения длительного эффекта необходимо, чтобы пробиотические бактерии присоединились к стенкам толстой кишки, закрепились среди аутохтонной микрофлоры, а еще лучше — в индигенной. Многочисленные исследования показывают, что это достижимо только в детском возрасте, еще эффективнее иммуномодуляция пробиотиками через иммунный статус матери при формировании иммунитета плода. Для взрослых людей значительная корректировка аутохтонной и индигенной нормофлоры трудноосуществима и небезопасна [14]. Наиболее эффективным путем профилактической коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике является восстановление его собственной нормофлоры, сформированной в процессе длительного онтогенеза. Добиться этого можно путем систематического использования метаболитов аллохтонных микроорганизмов, например находящихся в составе кисломолочных продуктов, в сочетании с пребиотиками.

Заключение

Основные выводы из представленного обзора следующие:

– возможно существенное повышение функциональности уже ставших традиционными кисломолочных продуктов (йогурта, мечниковской простокваши, ацидофилина и др.) посредством включения системных исследований антибиотической активности в интегральную оценку стартовых культур для этих продуктов;

– одним из главных перспективных направлений в области повышения функциональности традиционных кисломолочных продуктов является изучение природы метаболитов, показывающих наибольший антибиотический эффект в клинических исследованиях, в т. ч. факторов бактериоциногенности;

– в стремлении соблюдать низкокалорийную диету и поддерживать нормальный уровень холестерина нельзя полностью исключать из рациона сливочное масло или молочные продуты средней жирности, т. к. они являются хорошими источниками КЦЖК, необходимых для активации клеточного иммунитета;

– рекомендуется ежедневно употреблять цельные злаки, овощи, фрукты и другие естественные источники пребиотиков и не реже 2–3 раз в неделю кисломолочные продукты, соответствующие вкусу и возможностям конкретного потребителя.