Оценка качества лабораторной диагностики малярии в Самарской области

На постсоветском пространстве, где малярия ранее была ликвидирована, постоянно растет число завозных случаев заболевания и есть все условия для формирования местных очагов передачи (Россия, Азербайджан, Армения, Таджикистан). Таким образом, болезнь, «побежденная» в 50-е гг. XX в., возвращается.

В Российской Федерации заболеваемость малярией обусловлена завозными случаями, иногда вторичными от завозных, ежегодно наблюдаются летальные исходы тропической малярии. Серьезной проблемой для многих стран, в т. ч. для России, является так называемая аэропортная малярия, возникающая вследствие заражения посредством комаров, привезенных самолетами из эндемичных по малярии регионов.

Малярией[4] называют группу антропонозных протозойных трансмиссивных заболеваний человека, возбудители которых передаются комарами рода Anopheles. Известны четыре вида плазмодиев — возбудителей малярии человека:

• Plasmodium vivax — возбудитель трехдневной малярии;
• Plasmodium falciparum — возбудитель тропической малярии;
• Plasmodium malariae — возбудитель четырехдневной малярии;
• Plasmodium ovale — возбудитель овале-малярии трехдневного типа.

Между четырьмя видовыми формами малярии человека существуют различия в клинической картине, диагностике, эпидемиологии и профилактике. Они определяются особенностями жизненных циклов плазмодиев. Общим является то, что развитие малярийных плазмодиев происходит поочередно в организмах двух хозяев — комаров рода Anopheles и человека.

Клиническая картина малярии характеризуется периодическими лихорадочными приступами, анемией, увеличением селезенки и печени. Несмотря на многовековую практику, поставить дифференциальный диагноз на ранних стадиях весьма сложно, т. к. ведущим симптомом начала болезни является лихорадка, присущая большинству инфекционных заболеваний. В МУ 3.2.1756-03 и других нормативных актах, регламентирующих санитарно-эпидемиологический надзор за малярией, в качестве важного звена профилактики на низкоэндемичных территориях, таких как Россия, определено активное выявление и лечение больных малярией и паразитоносителей. Так, согласно п. 5.8 СанПиН 3.2.3215-14 обследованию на малярию подлежат:

• лица, прибывшие из эндемичных по малярии местностей или посетившие эндемичные страны в течение последних 3 лет, при повышении температуры, с любым из следующих симптомов на фоне температуры тела выше 37 °C: недомогание, головная боль, увеличение печени, селезенки, желтушность склер и кожных покровов, герпес, анемия;
• лица с неустановленным диагнозом, лихорадящие в течение 5 дней;
• больные с установленным диагнозом, но с продолжающимися периодическими подъемами температуры, несмотря на проводимое специфическое лечение;
• лица, проживающие в активном очаге, при любом повышении температуры.

В диагностике малярии важная роль принадлежит именно лабораторному исследованию крови. За последние 5–10 лет лабораторная диагностика малярии пополнилась многими современными методами. Среди них иммунологические реакции (непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохроматографический тест (ИХТ)), флюоресцентная микроскопия и полимеразная цепная реакция (ПЦР). У каждого из новых методов есть преимущества перед классической микроскопией: простота и быстрота в исполнении, высокие чувствительность и специфичность, оперативное обучение персонала даже без медицинского образования, использование для массовых обследований, ретроспективной эпидемиологической диагностики. Однако все новые методы имеют недостатки, которые пока ограничивают круг их применения. Так, например, для проведения НРИФ необходим флюоресцентный микроскоп, для ИФА требуется стандартизация антигена плазмодиев, ИХТ определяет в крови пока только антиген Plasmodium falciparum, флюоресцентная микроскопия является дорогостоящим методом, который к тому же не позволяет идентифицировать плазмодии до вида, применение ПЦР также связано с ощутимыми затратами. Существенным недостатком всех новых методов является невозможность или затруднения при определении интенсивности паразитемии, что необходимо для оценки тяжести течения заболевания и контроля за эффективностью лечения.

Поэтому пока основным остается классический метод — микроскопия препаратов крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Метод подробно изложен в МУК 3.2.987-00. Он представляет собой микроскопическое исследование крови двумя взаимодополняющими способами — «толстая капля» и «тонкий мазок». «Толстая капля» (чувствительность — 1 паразит в 0,2 мкл крови) является основным способом и единственным для исключения малярии. «Тонкий мазок» необходим для видовой идентификации, но его приготовление также обязательно.

Исследование крови на малярию классическим методом — сложный и ответственный процесс. Для его успешного выполнения от лабораторного персонала требуется точное знание методики и постоянное совершенствование навыков. Нарушения, допущенные на любом этапе метода, могут привести к получению непригодных для диагностики препаратов крови, исследование станет невозможным или будет недостоверным. В связи с этим органы Роспотребнадзора осуществляют постоянный контроль качества паразитологической диагностики малярии. Каждая лаборатория направляет для оценки все положительные, сомнительные и 10 % отрицательных препаратов крови на малярию в центральный испытательный лабораторный центр управления Роспотребнадзора в субъекте федерации.

Оценка качества диагностики малярии проводится следующим образом.

1 этап — регистрация и визуальная оценка по нижеперечисленным критериям:

• корректность и полнота информации, указанной в направительных документах;
• соблюдение требований по доставке проб биологического материала;
• наличие всех препаратов, необходимых для диагностики малярии («толстая капля» и «тонкий мазок»);
• наличие корректной маркировки образцов крови на предметных стеклах;
• наличие грубых (визуально заметных) дефектов в приготовлении и окраске препаратов.

2 этап — контрольная микроскопия. Оцениваются:

• соответствие предметных стекол требованиям действующей методики;
• соблюдение правил подготовки и хранения краски Романовского — Гимзы;
• корректность забора крови для приготовления «толстой капли»;
• корректность забора крови для приготовления «тонкого мазка»;
• качество окраски препаратов;
• лабораторный результат направившего учреждения.

3 этап — оформление заключения, которое содержит:

• перечень установленных дефектов по каждой пробе;
• определение категории качества препарата (соответствует требованиям методики, условно-пригоден, непригоден для диагностики малярии);
• результат паразитологического исследования пробы.

Вашему вниманию будет представлен анализ качества препаратов для диагностики малярии за 2008–2013 гг. Речь идет о 797 пробах, которые были направлены на контроль из более чем 70 лечебно-профилактических организаций (ЛПО) Самарской области и их подразделений. Подробнее в табл. 1.

Таблица 1. Количество препаратов, представленных на контроль

Таким образом, в Самарской области за 6 лет на малярию было обследовано 7223 пациента. В среднем в год обследуется 1204 пациента или около 100 человек в месяц. Суммарное количество лихорадящих больных и прибывающих из эндемичных по малярии регионов мира, конечно, намного больше. Это говорит о недостаточности охвата населения обследованиями, хотя основной мерой контроля над эпидемиологической ситуацией по малярии является активное выявление больных и паразитоносителей лабораторным путем.

Исследования в ходе анализа лабораторной диагностики малярии были выполнены тремя врачами-паразитологами в соотношении 29, 30 и 41 % от всего объема работы, что свидетельствует об объективности экспертной оценки качества всей совокупности препаратов (см. рис.).

Данные лабораторной верификации диагноза «малярия» в Самарской области за 2008–2013 гг. представлены в табл. 2.

Таблица 2. Лабораторная верификация диагноза «малярия»

Получаем за весь рассматриваемый период 191 пробу из 797, направленных на контроль, что составляет 24 % препаратов, результаты анализа которых не были подтверждены экспертами. Учитывая выборку среди отрицательных препаратов (10 %) и то, что совокупность всех препаратов в целом однородна, за 2008–2013 гг. мы получаем 1334 фактические пробы крови на малярию, в отношении которых диагностика заболевания в лаборатории была проведена недостоверно.

Причины недостоверной лабораторной диагностики малярии кроются в следующем:

• лабораторный диагноз установлен неправильно из-за недостаточных знаний по морфологии малярийных паразитов — 53 пробы из 191 (28 %);
• препараты признаны непригодными для диагностики — 138 проб из 191 (72 %).

Напомним, что каждая проба за 2008–2013 гг. была оценена с точки зрения качества. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Экспертная оценка качества препаратов крови на малярию

Непригодные препараты — это препараты крови, выполненные с грубыми нарушениями методики, неустранимыми дефектами. В первую очередь это «толстые капли», которые в совокупности содержат менее 200 полей зрения достаточной толщины (10–15 лейкоцитов) с равномерным гемолизом, окрашенных при рН = 7,0 ± 0,2. Фактически это пациенты, у которых требовалось исключить малярию, но достоверно этого сделано не было. Последствиями могли стать безуспешное либо несвоевременное лечение, развитие опасных клинических осложнений, даже летальные исходы и эпидемиологические последствия в виде возникновения очагов местной передачи возбудителей.

Условно-пригодные препараты — это пробы, подготовленные с нарушениями методики, имеющие незначительные дефекты, однако их можно использовать для лабораторной диагностики при наличии достаточного опыта микроскопии. Выделение этой категории проб необходимо для того, чтобы руководитель лаборатории своевременно обратил внимание на качество препаратов и скорректировал работу среднего персонала.

Почему же многие препараты являются непригодными и условно-пригодными? В таблице 4 все установленные дефекты за 2008–2013 гг. соотнесены с этапами метода согласно МУК 3.2.987-00.

Таблица 4. Нарушения, допущенные при микроскопии препаратов крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе

Как видим, значительное число грубых нарушений наблюдается в основном на этапе подготовки рабочего раствора краски и при заборе образцов крови для «толстой капли», которая, напомним, является ключевым способом. У большой части препаратов имеются сочетанные нарушения, одиночные дефекты встречаются гораздо реже.

Результаты контроля качества лабораторной диагностики малярии позволяют судить:

• о качестве лабораторной диагностики малярии в каждом конкретном ЛПО (основные нарушения, их систематичность, годовые показатели изменения качества);
• состоянии лабораторной диагностики малярии в отдельно взятых городах и районах Самарской области (с указанием наиболее распространенных ошибок);
• причинах появления ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования; и др.

Эта информация может быть полезна эпидемиологам, руководителям лабораторий для повышения качества диагностики малярии, а также разработчикам новых методов, которые, возможно, в ближайшем будущем модернизируют классический метод — микроскопию окрашенных препаратов крови по Романовскому — Гимзе, упростив его исполнение и повысив достоверность результатов.